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Chromatography 관련 자주 묻는 질문과 그에 대한 답을 확인해보세요.

  • [NEW] 단백질 구조를 보기 위해 단백질 정제를 하려고 합니다. 특히 Cryo-EM으로 분석을 하려고 하는데, AKTA series 중 어떤 모델을 선택을 해야 하나요?
    Cryo-EM 실험을 위해 단백질을 정제할 때의 주요 과제는 ul 정도의 제한된 샘플 볼륨과 단백질의 동일한 질량, 모양 및 크기의 분자로 구성이 되어야 한다는 것입니다. 즉 단백질의 입자가 용액에서 단분산이 되어야 한다는 것입니다.

    이러한 조건에 충족하기 위해서 나온 제품이 AKTA micro 입니다.

    AKTA micro는 AKTA pure에 비해 내부 볼륨을 최소화 하여 해상도를 높이며 적은 볼륨의 샘플도 로딩 및 분획이 가능합니다.

    AKTA micro와 함께 Cryo-EM 에 적합한 고해상도 컬럼은 Superdex™ Increase, Capto™ HiRes 이 있으며, 아래 데이터를 보시면 AKTA pure 와 AKTA micro 의 성능을 비교 하실 수가 있습니다.

    AKTA micro
  • [NEW] Mammalian cell line에서 유래한 his-tagged 단백질을 정제하려고 합니다. 어떠한 제품을 구매하면 될까요?
    Ni Sepharose Excel은 이러한 Application 에 사용할 수 있는 제품입니다.

    Cell culture 배지에는 일부 EDTA 유사 시약 및 Ni+ 이온을 제거하는 물질들을 포함하고 있는데, Ni Sepharose Excel은 EDTA 및 DTT와 같은 환원제에 대해 매우 높은 내성을 가지고 있습니다.

    따라서 Ni Sepharose Excel을 이용한다면, 금속 이온 스트리핑을 유발하는 물질을 포함한 배지를 제거하지 않고 샘플을 바로 로딩 할 수 있으므로 워크플로우를 크게 단순화 할 수 있습니다.
  • [NEW] 2M NaCl과 1M NaOH로 컬럼을 세척했습니다. 컬럼에서 NaOH를 제거할 때 압력이 증가하는데, 압력이 증가하는 원인이 무엇입니까?
    1M NaOH를 실행할 때 압력이 증가하는 것은 일반적인 현상입니다. 이 효과는 용액의 점도보다는 비드에 부착된 불순물의 결합력이 약해지기 때문입니다.

    그렇기 때문에 컬럼 세척시에는 꼭 압력 알람을 설정을 하고 high alarm에 도달하게 되면 유속을 낮추어 세척해 주셔야 합니다. 그리고 세척에 사용된 NaOH를 제거하기위해서는 최소 1.5 CV의 버퍼로 흘려주시기 바랍니다.
  • [NEW] HPLC보다 AKTA를 사용해서 단백질 정제를 하였을 경우 어떠한 이점이 있을까요?
    ÄKTA 시스템은 다음 단계의 실험 혹은 제품을 위한 대량의 단백질 정제를 위한 장비로 분획을 받기 위한 정제 시스템입니다.

    AKTA는 내염성, 저유량,저압력 크로마토그래피 시스템으로 펌프와 버퍼의 이동경로, 유연성 및 자동화 기능이 단백질 정제에 최적화되어 있습니다. HPLC에서 사용되는 고압 조건은 분석용에 적합하며, 단백질의 구조에 영향을 줄 수도 있습니다.

    이러한 특징으로 인해 AKTA는 단백질 정제에 최적화 되어 있는 시스템입니다.
  • [NEW] 크로마토그램에서 주어진 UV 흡광도로부터 단백질의 농도를 측정할 수 있을까요?
    네. 타겟 단백질의 흡광계수를 알고 있다면, UNICORN 7에서 간단하게 계산 할 수 있습니다.

    Evaluation 창에서 결과 파일을 더블 클릭 하시고 1번을 클릭해서 UV면적을 구합니다.

    그리고 2번의 흡광계수를 입력하시면, 단백질 농도와 함께 양을 확인 하실 수가 있습니다.

    AKTA_UNICORM
  • ÄKTA를 사용하지 않을 경우 어떻게 보관해야 할까요?
    아래 기간에 따른 ÄKTA 보관 방법을 참고하시기 바랍니다.

    <3일 이내 보관>
    • Column CIP 후 장비에서 제거
    • 아래의 Flow path를 모두 DW로 Washing (pumps, tubing, flow cells, valves, sample loop, fraction collector, accumulator- ÄKTA avant and ÄKTA pure with an F9-C)
    • pH probe는 storage buffer에 보관
    • ÄKTA는 “Pause” 가 아니라 “End” 상태로 보관
    • ÄKTA와 UNICORN software는 shut down 할 필요는 없음
    <3일 이상 보관>
    • Column CIP 후 장비에서 제거
    • pump rinse solution을 fresh 20% EtOH로 교체
    • 미지근한 DW로 장비 전체를 Washing (manually or system wash) (pumps, tubing, flow cells, valves, sample loop, fraction collector, accumulator- ÄKTA avant and ÄKTA pure with an F9-C)
    • 장비 전체를 fresh 20% EtOH로 채움
    • pH probe는 storage buffer에 보관
    • UNICORN software를 끄고 PC-> ÄKTA system 순서로 Shut down 한다.
  • ÄKTA system을 이용해서 천연 물질에서 소수성 단백질을 분리하기 위해 RPC column을 사용하려고 합니다. Fraction collector는 FR-C를 가지고 있는데 주의하여야 할 사항이 있을까요?
    ÄKTA pure 25 크로마토그래피 시스템을 사용하여 역상 크로마토그래피를 수행하려면 따라야 할 몇 가지 중요한 지침이 있습니다.

    1. 유기 용매는 일반적으로 단백질 분리에 사용하는 버퍼 보다 ​​PEEK 튜브 벽을 더 쉽게 약화시킬 수 있습니다. 장기간 동안 높은 압력에서 유기 용매를 사용할 때는 특히 주의를 해야 합니다.

    2. Mixer sealing ring을 유기 용매에 저항성이 높은 제품(제품 코드: 29011326)으로 교체를 해야 합니다.

    3. Pump piston sealing도 변경하는 것이 좋습니다.  사용하는 Acetonitrile 농도 및 압력에 따라 다르지만 piston sealing의 수명을 연장하려면 더 낮은 농도의 Acetonitrile을 사용하고 사용 후에는 즉시 Acetonitrile을 제거해야 합니다.

    4. Fraction collector F9-C를 사용하여 가연성 액체를 분획하면 화재의 위험이 있습니다. 유기 용매를 사용하는 RPC 방법 또는 기타 절차를 실행할 때는 outlet valve 또는 Fraction collector F9-R (제품 코드: 29011362)을 사용하십시오.
  • Q-Sepharose FF 컬럼을 장기 보관하려고 하는데 20% 에탄올이 아닌 다른 저장 용매를 찾고 있습니다. Isopropanol을 사용해도 괜찮을까요?
    Q-Sepharose FF에 대한 isopropanol의 장기 보관에 대한 연구가 없기 때문에 권장 드리지 못합니다. 그러나 benzyl alcohol에 대한 호환성은 검증이 된 용매이니 isopropanol이 아닌 benzyl alcohol을 권장 드립니다.

    이외 다른 크로마토그래피 레진에 대한 저장 용매는 각 제품의 Data File을 보면 확인이 가능합니다.
  • 5ml Mixer chamber가 있는 ÄKTA Pure 150을 사용하고 있습니다. 직격 7cm의 column을 사용하려고 하는데 15ml Mixer chamber로 교체를 해야 하나요?
    Mixer chamber의 volume은 사용하시는 유속에 따라 다릅니다. 일반적으로 최대 50ml/min의 유속에는 5ml mixer를 사용하며 50ml/min 이상의 유속에서는 15ml mixer를 권장 드립니다. 이는 유속이 빨라짐에 따라 좀 더 정확한 gradient를 만들어 주기 위함입니다.

    따라서 column 에 충진되어 있는 resin에 따라 사용하는 유속을 고려하셔서 선택하시면 좋을 것 같습니다.
  • Affinity tag의 종류와 정제 시 고려해야 하는 사항이 있을까요?
    단백질에 affinity tag을 추가하면 정제 및 검출이 비교적 쉬우며, target 단백질의 용해도와 안정성을 향상시킬 수 있습니다.

    Tag 선택 시 고려할 사항은 정제 목적, Tag 크기, 크로마토그래피 resin의 비용 등이 있습니다. 아래 표는 가장 많이 사용되는 4가지 Tag에 대한 주요 특징을 보여줍니다.

    His-tag은 단백질 정제에 일반적으로 가장 많이 사용하는 tag이며, binding capacity가 높은 반면 purity가 낮은 단점이 있습니다. Strep-tag는 purity는 높지만 binding capacity가 낮습니다. GST는 적절한 binding capacity와 purity를 가지고 있습니다.

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